盘点还在Th17检测中挣扎，这份攻略治愈你

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通常所说的T17是指在各种生理与病理条件下有能力分化为T17的辅助性T细胞(严格意义上是T0)。当受到外界因素(如刺激素、病原体等)刺激，T0即会向T1、T2、T17等T细胞分化，此时，通过检测分泌的细胞因子（如IFN-、IL-4、IL-17等）现对各类T细胞的检测。[url=http:///www.kosoer.com]化学试剂[/url]的最新消息可以到我们平台网站了解一下，也可以咨询客服人员进行详细的解答！[align=center]

                               
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T17：主要分泌IL-17、IL-22等促炎因子，介导自身免疫性疾病和炎症反应。




考虑到静息状态下T0分化为T1、T2、T17等的能力非常弱及流式细胞仪法检测分泌到细胞外的细胞因子等因素，检测T细胞时需要添加刺激剂及阻断剂。









我们通常选用的刺激剂为PMA(佛波酯)+I(离子霉素)，也有人选用CDCD28协同刺激、PHA刺激等来活化T细胞。验表明，PMA为广谱性刺激，即T细胞中的各亚群均会被PMA同等激活，而CDCD28协同刺激和PHA刺激，则是通过TCR受体的作用，仅对部分T细胞亚群有效。所以可根据验的需要来选择刺激方式。通常选用的阻断剂为BA(BFA,布雷非德菌素A)和或M(莫能霉素)，通过破坏高尔基体来切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。




另外，验过程中涉及到如何正确的选定T（即T辅助细胞）的问题。T细胞的表面标志为CD+CD4+，而当用PMA刺激4小时时，会发现CD4+的细胞明显减少，甚至消失，这是因为PMA会诱发细胞表面CD4分子被内吞。所以通常的做法是用CD和CD8反设CD4细胞，即CD+CD8-的细胞被认为是CD+CD4+的细胞。（注：PMA对小鼠CD4的影响很小，所以检测小鼠T17时可用CD4直接设门）。








T17检测步骤如下


样本制备




全血标本



用肝素抗凝管采集静脉血（必须用肝素钠抗凝，不可用肝素锂、EDTA或枸橼酸钠）1-2，血液室温或4℃放置，8小时内必须进行检测，否则需弃用。
外周血单个核细胞（PBMC）标本



1对于使用其它抗凝剂（如EDTA或枸橼酸钠）抗凝血，采集静脉血至少1，采集后4小时内使用；



2加入等体积的H液或不含C2+和M2+的PBS或生理盐水稀释血液；



取1淋巴细胞分离液加入离心管中；



4将稀释血液小心地加到淋巴细胞分层液上，注意保持两者界面清晰；



5室温下，1500，离心15分钟；



6用毛细吸管轻轻吸出单个核细胞层，加入含有4-5H液或不含C2+和M2+的PBS或生理盐水的试管中，充分混匀；



71500，离心10分钟，弃上清后，再洗一次；



8弃上清，用含10%胎牛血清的培养基重悬单个核细胞，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95％以上）；



9调节细胞浓度为1107细胞。







刺激效果检测（选做）




1全血标本：取125抗凝血至流式管中，加入125不含血清的培养基稀释到250；PBMC标本：用含10%胎牛血清的培养基重悬单个核细胞，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)；调节细胞浓度为1107，取250；



2在标本中加入1250PMAI，混匀；



7℃，5%CO2培养箱培养4～6小时，期间注意相隔1~2小时混匀一次；



4取100样本，加入HCD（或MCD4）和CD69PE（用量详见说明书），室温孵育20分钟（全血样本溶血）后，用流式染色缓冲液洗一遍，00离心5分钟，弃上清，用流式染色缓冲液重悬至500，上机检测；



5CD+（或CD4+）细胞中，CD69的阳性率应达到90%以上，进行下一步正式验。




正式验




1全血标本：取125抗凝血至流式管中，加入125不含血清的培养基和1PMAIM（250）和1BFAMM（250）。取125抗凝血和125不含血清的培养基，作为对照。混匀，7℃孵育4-6小时，每隔1-2小时取出震荡混匀；



1PBMC标本：用含10%胎牛血清的培养基重悬单个核细胞，使细胞浓度为1107。取250PBMC至流式管中，加入1PMAIM(250)和1BFAMM(250)。以只含PBMC的样本作为对照。混匀，7℃孵育4-6小时，每隔1-2小时取出震荡混匀；



注：PMAIM(250)和BFAMM(250)极易挥发，使用后请及时旋紧管盖。



2从样本管和对照管中取100细胞悬液至新的流式管中，加入5A-HCD,FITC和5A-HCD8,PCP-C55（或加入5A-MCD,FITC和5A-MCD4,PCP-C55）。震荡混匀，室温避光孵育15分钟；



每管加入100FIXPERMMA，震荡混匀，室温避光孵育15分钟；



4用蒸馏水将10FCSB稀释为1，每管加入2预冷1FCSB，00离心5分钟，弃上清；



注：液体尽量倒干净，不要有残留。



5每管加入100FIXPERMMB和5A-HIL-17A,PE（或5A-MIL-17A,PE）。震荡混匀，室温避光孵育15分钟；



6每管加入21FCSB，00离心5分钟，弃上清；



7每管加入5001FCSB重悬，上机检测；或者加入5001-4%多聚甲醛重悬，2-8℃避光，于24小时内检测。




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目录号
产品称
规格型号


70-KTH217
MT17小鼠辅助性T17细胞检测试剂盒
25T100T


70-KTH117
HT17人T17染色试剂盒
25T100T


70-KTH001
HT1T2T17人T1T2T17染色试剂盒
25T100T






结果示例












使用MT17SK进行流式检测。正常ICR小鼠的静息肝素抗凝血(A0)、EDTA抗凝血来源的PBMC(B0)、脾细胞(C0)和脾单个核细胞(D0)染色IL-17A。正常ICR小鼠的PMAI刺激的肝素抗凝血(A1)、EDTA抗凝血来源的PBMC(B1)脾细胞(C1)和脾单个核细胞(D1)染色IL-17A。对CD+CD4+细胞进行设门分析。