分析流式细胞术的各种荧光标记

shanhuqs

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荧光素按激发光波长来分，主要是激发波长为75、405、488和6四类。其中，常用的是激发波长为488和6的荧光素，如FITC、PE、APC、PI等。







激发波长为488的荧光素



01异硫氰酸荧光素



F，FITC是应用最为广泛的一种荧光素，经激光激发后发出明亮的绿色荧光，最大发波长为525。FITC的荧光强度受PH影响较大，常随着PH的降低而减弱。因此，在使用FITC时需格外注意溶液的酸碱度。



02藻红蛋白



P，PE是从红藻中分离纯化获得的一种常见染料，经激光激发后发出橙色荧光，最大发波长为575。PE具有吸光性能好和光量子产率高的特点，可用于标记表达水平较低的蛋白。在流式细胞术检测中，PE标记的抗体适用于所有配备488氩离子激光器的流式细胞仪。



0AF488



AF是美国分子探针开发的系列荧光染料。AF488的发光谱与FITC几乎一致，经激光激发后发出绿色荧光，最大发波长为519，但其荧光强度和稳定性要优于FITC。一般来说，AF488在H4-10范围内能保持较好的光稳定性。



04PE-C5



PE-C5是一种复合染料，属于藻红蛋白偶联物，在此类复合染料中，激发能量可从PE传递到C5上，最大发波长为667。由于PE-C5与FITC、PE在光谱上重叠范围小，荧光干扰少，因此验中常将PE-C5与FITC、PE搭配使用。需注意，PE-C5不适合与APC搭配使用，两者的光谱重叠范围大。



05PE-C55



复合染料，能量从PE传递到C55上，最大发波长为694。与PE-C5不同，PE-C55和APC之间的荧光干扰小，可搭配使用。并且，PE-C55的荧光强度要优于PE-C5。



06PE-C7



复合染料，最大发波长为785。PE-C7与FITC光谱重叠，与APC重叠也较少，因此其可与FITC、PE、APC搭配使用。在验中需要注意，PE-C7的光淬灭性很强，需要绝对避光环境。



07PCP-C55



复合染料，最大发波长为695。PCP的光量子产率较低，适用于表达水平较高蛋白的检测，而PCP-C55光量子产率高，可用于表达水平较低蛋白的检测。在双激光管仪器上与APC共同检测时，需要做补偿调节，但比PCP补偿少。



08PI7-AAD



碘化丙啶（，PI）和7-AAD（7--D）的最大发波长分别为617和647，常用于细胞凋亡检测。在大部分流式细胞仪上，PI在FL2或FL通道检测，7-AAD在FL通道检测。7-AAD同PI有着相似的荧光特性，但其发光谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。




激发波长为6的荧光素



01别藻青蛋白



A，APC最大发波长为660，其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪，检测通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC是经典的色搭配组合。



02C5



C5属于小分子染料，最大发波长为670，其标记的抗体适用于所有配备6氩离子激光器的流式细胞仪，检测通道一般是FL4通道。除流式细胞术外，C5同样适用于传统的荧光显微镜技术。需注意的是，C5与单核细胞、粒细胞的非特异性结合多，验结果容易出现假阳性。



0AF647



AF647是一种明亮的红色荧光染料，最大发波长为668，一般在流式细胞仪的FL4通道检测。AF647具有光量子产率高、光稳定性好、适应的PH范围广和不易淬灭等特点，是APC和C5的优质替代品。













二、荧光素选择与搭配




在流式细胞术的细胞免疫学检测及免疫分型等验中，各种荧光素偶联的抗体是必不可少的。荧光素的选择和搭配，通常会从以下5个方面进行考虑：



01流式细胞仪的配置



仪器需配备可激发相应荧光素的激光管；对于多荧光素验，仪器可同时检测多种细胞荧光。



02染料的亮度与抗原表达量相适应



低表达量的抗原，推荐使用高亮度荧光素；高表达量的抗原，推荐使用低亮度荧光素。








0荧光素之间的光谱重叠最小化



尽量选择光谱重叠小的荧光素组合，如FITCPE-C7；选择不同激光激发的荧光素组合，如FITCAPC、PEAPC。








光谱重叠严重的荧光素同时检测会导致荧光溢漏，干扰检测结果，需调节补偿。




04避免复合染料联合使用带来的假阳性



常见的复合染料有PE-C5、PE-C55、PE-C7、PCP-C55、APC-C7等，复合染料的信号衰退会降低APC或PE的灵敏度。如果出现信号衰退，则：



●减少样本暴露于光、高温或固定剂；



●选择染料时考虑：复合染料的信号衰退会降低APC或PE的灵敏度，避免染料和其衍生物在同一细胞上标记。选择更稳定的-（PC-C55）；



●如果样本需固定，选择稳定、可有效阻止复合染料信号衰退的固定剂多聚甲醛：冰上固定10，离心除去多聚甲醛，将样品重悬于PBS中。



05尽量使用红色激光激发自发荧光高的样本



每种细胞群都有不同水平的自发荧光。所有的荧光通道均可观察到自发荧光，但自发荧光强度在波长较长时迅速降低。对自发荧光较强的细胞，选择红光激发，发波长长的荧光素（如APC）可得到较好的SN比值；对自发荧光比较弱的细胞，发波长长的荧光素对SN提高没有明显的改善，可选用FITC。




流式细胞术对荧光素的选择搭配有着很高的要求，尤其是对于多色验来说，荧光素搭配效果直接影响到检测效果。希望上面这些知识可以更好地帮助您选择荧光素。








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